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表观遗传学

表观遗传学是一种不涉及核苷酸序列改变的遗传性表型变化的研究,在基因表达中起着关键作用,并与包括癌症在内的许多疾病相关。 由于 PCR 消除了碱基修饰,通过传统测序技术对其进行检测需要使用特殊的文库制备步骤,这些步骤会损坏核酸,导致测序读长序列非常短。 使用纳米孔测序时,无需进行 PCR,可保留和直接检测 DNA 和 RNA 修饰,无需额外的文库制备步骤。可在单个数据集中鉴定长程表观遗传变化、结构变异和单核苷酸多态性。

表观遗传学——检测核苷酸序列的同时常规检测碱基修饰

使用长测序读长对表观遗传学 DNA 修饰进行单倍型分型,或将 RNA 修饰明确地匹配至转录本异构体

使用全基因组或无扩增靶向测序方法

介绍

以高再现性和低偏好性直接检测基因组甲基化

使用纳米孔测序技术,研究人员已经在核苷酸分辨率直接鉴定了 DNA 和 RNA 碱基修饰,包括DNA 中的 5mC、5hmC、6mA 和 BrdU,以及 RNA 中的 m6A,并通过训练碱基识别算法检测其他天然或合成的表观遗传修饰。
5-甲基胞嘧啶(5mC)是最普遍的基因组修饰之一,最常出现在 CpG 二核苷酸上。 与传统用于 5mC 检测的全基因组亚硫酸氢盐测序方法相比,纳米孔技术以更少的测序数据,识别到了更多的基因组中 CpG 位置数量,且显示出更均衡的基因组覆盖率和更低的 GC 偏好性,分析运行时间也大大缩短(图1)。
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Epigenetics-figure1-benchmarking
图1:使用来自 NA12878 人类基因组的两个重复样本,在单个 PromethION™ 测序芯片上测序,产生的基因组数据用于进行 5mC 甲基化识别的基准测试,获得每个样品 20X 的覆盖深度。 使用 Oxford Nanopore 开发的 Megalodon工具,将甲基化识别与两个 50X 的短读长亚硫酸氢盐测序数据集(来自 ENCODE 和 GEO)进行比较(a)。与亚硫酸氢盐测序方法相比,纳米孔技术显示:定位的均一度更高(b);GC偏倚的影响大大降低(c);读长序列深度要求更低(d-f);再现性更高(g);分析速度更快(h)。

Epigenetics - Methylation Fig3
图 2:纳米孔长读长和均衡的覆盖深度支持准确的、长程、且可解析单倍型的甲基化检测。 在图 1 所示的甲基化基准数据(NA12878)中,在已知的印迹基因组区域鉴定出了包含 BCAP31ABCD1 基因的差异性甲基化。

通过长纳米孔读长准确进行甲基化单倍型分型

CpG 二核苷酸处 5mC 的甲基化过高和过低均显示与疾病相关。 利用纳米孔技术,能够识别出这种差异性甲基化,并以核苷酸水平的精确度将其进行单倍型分型(图 2)。
碱基修饰可在整个基因组中进行检测,或者通过无需扩增的、基于 CRISPR/Cas 的富集在靶向基因组区域中进行检测。 使用直接测序意味着即使碱基修饰不是您 DNA(或 RNA)测序研究的主要目标,也可以在以后的任意时间点对数据进行分析。
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研究案例

检测人类基因组重复区域中的甲基化

“我们仅仅只是触及了这些[重复]区域对表观遗传调控的表面。”
Ariel Gershman
受限于传统短读长测序技术探访重复富集区域的能力,该区域在人类基因组中仍未得到充分探索。 在美国约翰霍普金斯大学,Ariel Gershman 及其同事一直致力于使用纳米孔长读长来揭示人类基因组中过去未经探索的大型重复序列的甲基化。高阶重复序列(higher order repeats; HORs)为着丝粒相关的组蛋白变体 CENPA 提供结合位点. 在对染色体着丝粒处的高阶重复序列进行分析后,揭示出独特的低甲基化和高甲基化模式。 她的团队首次证明了纳米孔读长序列能够揭示高阶重复序列和其他类别卫星重复序列的远程及等位基因特异性甲基化模式。 这些分析有可能增进我们对甲基化在染色体分离中的作用,及其与遗传疾病的关系的理解。
ariel-gershman
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工作流程

我该如何使用纳米孔测序检测碱基修饰?

PromethION 适用于较大基因组的高通量表观遗传研究,如人类和众多植物基因组;MinION 和 GridION 设备是微生物基因组、或真核转录组、以及目标基因组区域的表观遗传分析的理想选择。为保留碱基修饰,需进行无扩增的文库制备。对于 DNA 测序,我们推荐使用连接测序试剂盒。对于 RNA 修饰分析,需要使用直接 RNA 测序试剂盒。纳米孔测序是当前唯一可用于对天然 RNA 进行直接测序而无需扩增或逆转录的技术。取决于您的实验目的,可选择 Oxford Nanopore 和社区开发的众多工具用于识别修饰碱基。如需简单的一键法,我们将 5mC 和 m6A 的检测功能整合到了纳米孔测序设备软件 MinKNOW 中。如需在人类基因组中实现最佳的 5mC 甲基化识别性能,我们推荐使用分析工具 Megalodon
表观遗传学工作流程
查看人类基因组中识别和 5mC 单倍型分型的工作流程:从 DNA 提取和文库制备,到纳米孔测序和分析。
Epigenetics workflow

开始使用

在植物和动物中检测基因组范围的碱基修饰

对于在植物和动物中进行全基因组的修饰碱基检测,我们建议采用以下方法:
使用 Flongle, MinION, GridION 或 PromethION 扩展您的需求

希望得到相对较低的通量?

详细了解我们的低通量测序平台,包括MinION Mk1B和Mk1C。

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