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基因表达

从临床研究到发育生物学,基因表达分析在许多应用中至关重要。然而,在使用传统短读长 RNA 测序技术时,需要片段化 RNA 样本,随后进行计算组装,而这可能导致多重定位,并且限制定量的准确度,还可能进一步受限于 PCR 偏好性。相比之下,使用纳米孔长读长可以对转录本进行端到端得测序,从而在单个数据集中对异构体进行简单、准确的定量和鉴定。无需 PCR 的文库制备选项消除了 PCR 偏好性,而直接 RNA 测序可同时检测碱基修饰。

使用长测序读长在异构体水平准确鉴定和定量全长转录本

以低起始量生成高产测序

通过直接 RNA 测序探索表观遗传修饰,使用无 PCR 的方法消除偏好性

介绍

在异构体水平分析基因表达

传统的 RNA 测序基因表达研究通常采用 50-100 个核苷酸的测序读长。尽管这种短读长可以进行基因表达分析,却无法区分转录本异构体。转录本异构体能够表现出不同的表达水平和功能特性,因此十分重要(图 1)。采用纳米孔测序时,读长长度等于 RNA(或 cDNA)的片段长度,使其能够对全长转录本进行明确的分析,从而在异构体水平对基因表达进行准确的鉴定和定量(图1)。使用纳米孔测序,已生成长度超过 20 kb 的全长转录本。了解更多关于剪接变异的信息。
RNA isoforms wp
图 1:选择性剪接会导致每个基因生成大量的 mRNA 异构体,进而改变蛋白组成和功能。使用传统 RNA 测序技术生成的短读长会丢失位置信息,增加了正确组装选择性 mRNA 异构体的难度。长纳米孔 RNA 测序读长可以覆盖全长转录本,简化转录本的鉴定和定量。

Figure 3 RNA Whitepaper
图 2:包含扩增的测序工作流程容易受到序列特异性偏倚的影响。使用三种纳米孔测序技术(PCR-cDNA、直接 cDNA 和直接 RNA),以及一种典型的短读长 cDNA 技术制备酵母转录组文库。在所有情况下,纳米孔数据集中的 GC 偏倚均低于短读长数据集(参见海报)。

无偏倚的基因表达分析

研究表明,PCR 扩增文库通常比总 mRNA 库呈现出较低的复杂性。并非所有转录本都以相同的效率扩增,这导致部分 RNA 分子被漏掉,而其他 RNA 分子则过度扩增。使用已知存在 GC 偏好性的传统短读长测序技术时,会加剧这些问题,导致 GC 含量低或高的序列代表性不足。Oxford Nanopore 除了提供低偏好性的基于 PCR 的 cDNA 测序试剂盒,还提供无扩增直接 cDNA 和直接 RNA 测序试剂盒。这些试剂盒已被证明可以提供更准确的总 mRNA 表达和定量,且 GC 偏好性少于传统短读长 RNA 测序方法(图 2)。纳米孔技术能直接对天然 RNA 进行测序,这种独特的功能也可以保留和分析碱基修饰,提供更全面的基因表达数据。

高产量的全长转录本

与传统的短读长测序技术相比,纳米孔测序技术提供的长读长和全长转录本序列,已显示可以减少差异基因表达研究所需的读长序列总数。 例如,Bayega 等人报道,检测相同数量的基因所需的纳米孔 cDNA 读长,比短读长技术所需的读长数要少 40 倍。 此外,纳米孔测序提供了更长读长序列可减少多重定位,从而提供了对基因表达的更精确的见解。多重定位是单条读长定位到基因组或转录组中的一个以上位置(参见海报)。 Oxford Nanopore 提供了三种精简的 RNA 测序试剂盒,每种试剂盒均能够以低起始量中获得高测序产出(表 1)。
RNA kit comparison
表 1:Oxford Nanopore 提供了三种不同的 RNA 测序方法,包括无需 PCR 和无逆转录的方法。

研究案例

发育中橄榄果蝇胚胎的转录动力学

“我们生成了一种橄榄果蝇的从头转录组组装,发现了 3553 个新基因和总共 79810 个转录本;与使用NCBI预测的转录组相比,转录组多样性增加 4 倍。”
Bayega 等人
通过全长纳米孔 cDNA 测序,Bayega 研究了橄榄果蝇早期胚胎阶段的异构体复杂性和转录动力学 (橄榄果蝇是种植橄榄树最重要的虫害之一)。在胚胎发育的前 6 小时内,对这些生物体进行性别测定。通过研究该关键发育阶段中特定时间点的差异基因表达,团队计划开发新的基于性别的虫害控制方法。
下载研究亮点 Read more
Research spotlight olive fruit fly
cDNA 测序指南
下载 cDNA 测序入门指南

工作流程

我该如何使用纳米孔测序进行基因表达分析?

Oxford Nanopore 提供 3 种RNA 测序试剂盒用于基因表达分析,且所有试剂盒均提供低 GC 偏倚的全长转录本。试剂盒的选择取决于您的特定研究要求,包括样本量、样本混样建库要求、碱基修饰检测和所需的读长数量。
纳米孔测序具有独特的扩展性,以适应您的通量和产出要求。从便携式 FlongleMinION 设备,扩展到灵活的 GridION,以及超高通量 PromethION 平台。纳米孔社区和 Oxford Nanopore 均有许多强大的工具可用于分析全长纳米孔 RNA 测序读长。访问纳米孔社区的“生物信息学”章节,查看数据分析指南。
关于使用纳米孔技术从样本制备到数据分析进行基因表达研究的最佳实践建议,请查阅我们的 cDNA 测序入门指南
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了解使用全长纳米孔 RNA 测序进行基因表达分析和选择性剪接分析的更多优势。
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低样本量的差异基因表达分析

MinION 测序仪与 cDNA-PCR 测序试剂盒及 MinION 测序芯片联用,通常可提供 700 万至 1200 万个读长,使其适合低样本数量的差异基因表达分析。亦可使用 PCR 条形码试剂盒实现样本混样建库。
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