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鉴别

及时、灵敏地识别所有分类领域中的生物,对从临床研究、环境保护到法医鉴定的众多应用至关重要。 但是,通过传统测序技术进行的鉴定可能需要数天、数周或更长周期。短读长测序序列还可能限制分类学的解析分辨率。 借助纳米孔测序,可以在数小时内即完成鉴定,对于时间敏感的实验,能够在实验室或样品源处进行快速鉴定。而通过长读长测序序列,可实现前所未有的分类学分辨率和鉴定。

准确,可靠地识别和鉴定生物

通过 10 分钟的文库制备和实时测序,获得快速样本-答案周期

通过便携式纳米孔测序技术在样本源鉴定生物

介绍

通过短读长和长读测序序列识别生物

测序技术的使用改变了生物学领域对生物体的识别和区分,实现前所未有的、超过单独使用形态学检测所进行的解析。在临床研究或环境样本中鉴别病原菌及其抗菌药物耐药基因可以帮助公共卫生部门作出响应,而确定植物疾病的原因在农业和环境保护方面很重要。在监测非法野生动植物贸易时,可以在没有充分形态学线索的情况下识别出动物产品。但短读长测序可能导致分类解析存在局限性。短读长可能会定位到多个生物体,使细菌的菌株或血清型识别变得困难或不可能;此外,如果需要进行 PCR,测序中可能无法检测到难以扩增的区域或全基因组,例如有重复或高 GC 含量的区域或全基因组。
采用纳米孔测序时,读长没有上限,这意味着可在无需片段化的情况下对 DNA 和 RNA 分子进行测序,最长已获得长度超过 4 Mb 的序列。这可大幅减少测序读长的多重定位,能够在种属、菌株甚至血清型方面明确鉴别样本中的生物体。可在几个或单个读长中对整个病毒或细菌基因组进行测序,大幅简化了组装 ‚或完全无需组装(图 1),并生成完整、闭环的基因组。还可以充分解析抗菌药物耐药基因及其位置。长读长还能更好地解析有复杂大基因组的生物体:在追踪非法转基因修饰的植物时,可以对转基因进行全面测序。无需进行 PCR,可对整个基因组(包括无法扩增的区域)进行测序,并可同时检测天然 DNA 和 RNA 的修饰,为基因组的完整表征提供进一步信息。
Long reads enable identification of full-length marine viruses
图 1:纳米孔长读长测序可覆盖整个病毒或细菌基因组,可以在宏基因组样本中对其进行明确鉴别。在此图中,海洋病毒的完整基因组在单条读长中被测序,无需进行下游组装。查看海报了解更多信息。

Rapid identification of bacterial, archaeal, fungal, and viral species
图 2:EPI2ME “What’s In My Pot?” (WIMP) 分析工作流程可实时识别样品中的细菌、古细菌、真菌和病毒物种。

快速鉴别 - 在实验室或在现场

对于许多应用而言,快速鉴别生物体至关重要。采用传统、集中化方法,采集测序样本并运送至配备必要的制备和测序设备的实验室,可能需要数天、数周或更长时间;样本在此过程中也可能降解,限制检测含量。如果测序设备的成本过高,将样本发送至测序提供商可能意味着等待长达数月才能出结果。
相比之下,Oxford Nanopore 提供简单的文库制备解决方案和便携式测序装置,可以在实验室或采样点进行测序。口袋大小的 MinION 可以在笔记本电脑上运行,而新的 MinION Mk1C 是一个完整、独立的测序仪,将一个屏幕和机载计算机集成在一个便携式装置上。实时提供测序读长,可立即获得结果。对于微生物,Oxford Nanopore 提供 EPI2ME WIMP 分析工作流程,提供实时的种属微生物鉴定(图 2)。使用文库制备试剂盒(如冻干现场测序试剂盒)可以在短短 10 分钟内制备文库,结合此类试剂盒后,可以在采集后几小时或更短时间内进行生物体鉴别。MinION 启动包能够以低成本进行测序。

研究案例

使用 Flongle 对人肠道病毒进行快速、经济有效的基因分型

全世界每年有数百万人感染肠道病毒。已知有 100 多种可感染人类、与从轻度呼吸道症状到重度神经系统疾病在内的疾病相关的肠道病毒基因型,频繁对传播和新兴的基因型进行监测十分重要。尽管当前人肠道病毒鉴别的标准方法使用短读长 Sanger 测序,但 Grädel 等人证明了将 Flongle 测序芯片用于快速、低成本肠病毒基因分型的未来潜力。采用巢式 PCR 法扩增 26 份肠病毒阳性临床研究样本中的 VP1 基因,并使用 ”PCR 条形码扩展试剂盒 1-96“ 为这些基因添加分子条形码。然后混合带有分子条形码的扩增子,使用连接测序试剂盒制备在 Flongle 上进行测序。通过在一个定制的 VP1 肠道病毒数据库中进行定位,对共有序列进行基因分型。该团队发现,通过单次 Flongle 运行,26 份样本全部被正确进行基因型分型,使用 22.5 小时的端到端工作流程,每份样本的总成本为 10美元。然后,他们证明了每个样品都可以一式两份运行,从而在单张测序芯片上分析 52 份样本,而测序质量没有降低。这使每份样本的基因分型成本减少到 7 美元。
”我们得出结论,基于 Flongle 的测定周转时间快,成本投入少,每份样本的成本低,是一个用于肠道病毒鉴别和基因分型的准确、可重复和经济有效的平台。“
Grädel 等人
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鉴别

工作流程

我该如何使用纳米孔测序进行鉴别分析?

Oxford Nanopore 提供各类试剂盒、测序仪和分析工作流程,以满足您的实验目标。
纳米孔测序具有独特的可扩展性。便携式 FlongleMinION 和 MinION Mk1C 尤其适宜在采样点进行鉴别实验,而灵活的 GridION 可以根据需要运行多至五张 MinION 或 Flongle 测序芯片。扩展的超高通量 PromethION 平台可产出 TB 级数据,能够对更大的基因组进行快速测序或进行高度平行的混样建库实验。
对于周转时间至关重要的应用,快速建库测序试剂盒可以在短短 10 分钟内制备测序文库;完全冻干的野外测序试剂盒可用于在现场进行测序。对于靶向测序实验,可以使用几种基于 PCR 的方法,而 Cas9 富集可以与连接测序试剂盒合用,进行无 PCR 的长读长靶向测序。对于转录本和 RNA 病毒鉴别,Oxford Nanopore 提供 3 种用于 GC 偏倚低的长读长 RNA 测序试剂盒
EPI2ME WIMP 工作流程可实时鉴别细菌、古细菌、真菌和病毒,无需既往的生物信息学经验。关于数据分析指南以及纳米孔社区和 Oxford Nanopore 的分析工具的更多信息,请访问纳米孔社区的生物信息学资源。
希望获得端到端的鉴别工作流程?
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开始使用

从环境样品中鉴定细菌和抗菌素耐药基因

使用连接测序试剂盒进行文库制备,随后在 MinION 测序仪上使用 MinION 测序芯片进行测序,可提供多达 30 Gb 数据。测序开始后可立即进行碱基识别和后续分析,EPI2ME ARMA 工作流程提供种属鉴定和实时抗菌药物耐药分析。
MinION Mk1C Icon

有较低的样本起始量,测序较小的转录组,或进行靶向分析?

检查 cDNA-PCR 测序试剂盒和 MinION 测序平台。

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