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单细胞测序

对单个细胞进行基因组和转录组异质性分析为许多研究领域(包括癌症研究、细胞发育和功能以及免疫学)提供了新见解。但使用传统的短读长测序技术时,单细胞测定存在局限性;例如,在转录组研究中,无法在异构体方面确定转录本丰度。长读长纳米孔测序解决了这些挑战,可以在单条读长中对全长转录本和大基因组区域进行端到端的测序,并覆盖重复区域和结构变异。

在异构体水平的单细胞转录组中测序全长 RNA 转录本

鉴定整个分子中的剪接、嵌合转录本和序列多样性

通过一系列纳米孔测序平台扩展您的需求

介绍

单细胞、异构体水平鉴定 RNA 转录本

基于短读长的单细胞RNA测序(scRNA-Seq)方法仅从靠近转录物一端的小区域中产生信息,不具备对分子内的剪接、嵌合转录本和序列多样性进行分析的能力。 相比之下,纳米孔技术无需片段化,也无读长限制,可对整个 RNA (cDNA) 分子进行测序。因而可以在单条读长中测序全长转录本,从而在异构体水平进行准确地鉴定和定量(图 1)。
Single cell How barcoding UMI's work
图 1:单细胞测序的效力来自于其混合、测序并随后识别数百个个体细胞的转录本的能力。源自同一细胞的所有转录本均可使用一个唯一的细胞条形码(细胞BC)进行识别。在扩增前为原始转录本添加一个独特分子标识符(UMI),可进一步识别可能影响转录本定量的 PCR 副本,并可用于生成更准确的共有序列。短读长测序技术仅能读取大约 50 bp 的转录本序列,无法识别转录本异构体。相比之下,纳米孔长读长测序可覆盖整个转录本,从而对单个细胞在异构体方面进行深入的基因表达分析。

single cell  human 20fig207
图 2: Volden 等人开发的滚环扩增到串联共有序列(R2C2)方法提供高产出、高准确度的全长转录本。图片由加利福尼亚大学圣克鲁兹分校的 Christopher Vollmers 博士提供。

准确、高度混样建库的全长单细胞 cDNA 测序

加利福尼亚大学圣克鲁兹分校的研究人员证实, MinION  和  PromethION 测序芯片提供的高测序产出,与独特分子标识符(UMIs)及其新颖的 R2C2 方法结合使用时,可生成高度准确的转录本共有序列,完全无需任何短读长,简化了实验工作流程(图 2)。通过这种方法,Volden 等人测序了约 3000 个外周血单核细胞的 900 万个全长 cDNA 分子。这些数据可根据转录本特征对细胞类型(即 B 细胞、T 细胞、单核细胞)进行聚类。此外,每种细胞类型还在异构体方面生成转录组。
研究人员表示:“这项工作代表了一种新型的、简单而强大的方法,使用一种测序方法即可以从数千个单细胞中获得前所未有的信息量。”

研究案例

高通量、错误校正的纳米孔单细胞转录组测序

“…将高通量的纳米孔测序与UMI指导的误差校正相结合,既能实现以高可信度鉴定转录本异构体,又可鉴定单个细胞中的序列异质性。”
Lebrigand 等人
Lebrigand 等人证实,在传统短读长单细胞测序方法的基础上运用纳米孔长读长测序能够准确分析全长转录本。使用 10x Genomics 技术进行细胞分离后,将来自 E19 小鼠脑库的 1141 个细胞分两批在 PromethION 设备上进行长读长纳米孔测序,并进行短读长测序。使用短读长数据识别每个转录本的细胞条形码(细胞BC)和相关的独特分子标识符(UMI)。然后使用这些数据帮助将细胞条形码和 UMI 分配到与基因组比对后的纳米孔测序读长。
该团队总共鉴定出了 18,439 个先前注释的转录本,以及 15,317 个新型转录本,证明了将长测序读数整合到单细胞转录组研究中的强化功能。通过数据能够区分不同的细胞类型,并鉴定出不同细胞类型之间的差异异构体表达。此外,全长读长序列还为谷氨酸受体 Gria2 中单个 SNV 的关联提供了更详细的见解,并鉴定了细胞类型内部和之间的序列异质性。
单细胞 - 观看演讲
PromethION with kits and flow cells

工作流程

我该如何使用纳米孔技术进行单细胞 RNA 测序?

Volden 等人描述的 R2C2 方案分别针对 MinION 或 PromethION 测序芯片生成最多 490 万和 2200 万个读长,中位读长约为 3 kb。使用连接测序试剂盒进行文库制备,Oxford Nanopore 以及纳米孔社区均有许多工具可用于分析纳米孔 RNA 测序数据。为了更详细地了解单细胞转录组学数据的分析,我们推荐查阅 Volden 等人Lebrigand 等人的发表文章。
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人类和动物细胞的单细胞转录组学

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