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剪接变异

在健康变异和疾病的研究中,差异剪接异构体的鉴定及其功能作用非常重要,异常剪接与癌症和神经系统疾病等病症有关。然而,传统的短读长 RNA 测序(RNA-Seq)法通常无法跨越全长异构体,需要对其进行计算重新组装,从而可能导致错误的重构。 借助纳米孔长读长,可在单条读长中对异构体进行端到端测序,从而可以在单个数据集中进行明确地鉴定和同步定量。

使用长测序读长准确解析和定量全长剪接变体

通过直接 RNA 测序同步识别表观遗传修饰和核苷酸序列

通过一系列测序平台扩展您的输出需求

介绍

什么是选择性剪接?

剪接是以细胞特异性或时序特异性(例如在发育期间)的方式调节异构体表达的重要机制。不同类型的可变剪接已经得到了描述,包括最常发生的外显子跳跃,以及内含子保留(图1)。据估计,在人类中有 95% 的多外显子基因发生选择性剪接,每个基因平均产生 3 个转录本
Mathur, M. 
1
选择性剪接可对产生的蛋白质产生巨大影响。例如,可以改变蛋白质-蛋白质相互作用,抑制酶功能,或者可以改变表达的位置(例如,从细胞表面到分泌)。这种剪接变异可对疾病风险
Scotti, M. and Swanson, M. RNA mis-splicing in disease. Nat. Rev. Genet.17, 19–32 (2016)
2产生显著影响,疾病进展甚至药物反应
Gregory, A. 
3
RNA 剪接最早是在 1970 年代
Berget, S.M., Moore. C., and Sharp, P.A. Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,8: 3171-5 (1977).
4,
Chow, L.T. 
5末期,通过分析腺病毒 RNA 排列而发现的。与人类,植物和动物的较大基因组相反,剪接能够有效利用病毒的小型基因组。在腺病毒中,差异剪接控制着感染不同阶段的基因表达,进而控制蛋白质的产生。
Figure 1
图 1:6 种选择性剪接类别。外显子用有色方框表示,内含子用黑色水平线表示。对于每种类别,不同的剪接反应用红线表示。对于选择性的 5'剪接位点或 3'剪接位点,使用上游 5'剪接位点或下游 3'剪接位点会分别生成更短的上游或下游外显子。

SV Figure 2
图 2:选择性剪接会导致每个基因生成大量的异构体。创建一个果蝇转录组数据集,使用 minimap2 进行定位,使用 IGV 对其进行可视化,并使用 pinfish 分析流程(由 Oxford Nanopore 开发)重建异构体。与 Ensemble 的参考异构体集相比,可以看到较高的外显子和转录水平的精确度。

使用纳米孔长读长测序准确表征剪接变异

对剪接变异的全面分析受限于短读长测序,尽管它可以观察到外显子连接,但对解析完整异构体却面临巨大挑战。使用纳米孔测序时,读长等于片段长度,这意味着能够在单条读长中对整个转录本进行测序。在单条读长中已能够测序长度为 20 kb 的全长转录本,大幅简化了整个异构体的鉴定和定量(图 2)。
除了分析 cDNA 分子外,纳米孔技术还有对天然 RNA 分子进行直接测序的独特性。这使得碱基修饰信息可以与核苷酸序列数据一起获得,无需额外的样品制备或测序运行即可获取表观遗传数据。因此,Oxford Nanopore 的测序技术大幅简化了甲基化与剪接变异之间关联的研究。例如,最近在腺病毒中描述了通过 N6-甲基腺苷(m6A)修饰进行的剪接调控
Price, A. M. 
6。使用纳米孔直接RNA测序,可以在核苷酸水平鉴定 m6A 修饰,并且由于可以使用长读长精确定位重叠的剪接单元,因此也可以在转录水平准确解析甲基化。

研究案例

神经精神基因的深入剪接分析

我们的研究显示,长读长测序可用于选择性剪接的转录本的注释和鉴定。
Clark 等人
编码电压门控钙通道 CaV1.2 的基因 CACNA1C 内的遗传变异与神经精神疾病(包括精神分裂症和双相障碍)相关,然而其潜在的遗传关联的基础尚且未知。通过对全长 CACNA1C 转录本进行长程 PCR 和纳米孔 cDNA 测序,Clark 等人对死后人类大脑组织中的剪接变体进行了深入分析。本研究揭示了 CACNA1C 剪接真正的复杂性 :观察到 38 个新的外显子,发现的总共 251 个转录本中有 241 个为新发现。他们发现许多新的转录本被大量表达并编码功能改变的异常蛋白质产物。研究人员表明,如此详尽的结果有助于我们了解这些神经精神疾病,并提供潜在的药理学靶点。
cDNA 测序指南
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工作流程

我该如何使用纳米孔测序进行选择性剪接分析?

Oxford Nanopore 提供 3 种可用于基因表达和下游剪接变异分析的 RNA 测序试剂盒,所有试剂盒均提供全长转录本。试剂盒的选择取决于您的特定研究要求,包括样本量、样本混样建库要求、碱基修饰检测和所需的读长数量。
纳米孔测序平台的范围使您能够根据您的通量和输出要求,从非常适合靶向剪接变异分析的便携式装置 FlongleMinION,扩展到适用于全转录组研究的模块化 GridION 和超高通量的 PromethION P24/48 平台。 Oxford Nanopore 提供分析指南用于转录本挖掘和注释;这些指南见纳米孔社区的生物信息学部分。第三方分析工具也可在 Oxford Nanopore 网站的资源中心找到。 关于使用纳米孔测序技术从样本制备到数据分析进行剪接变异研究的完整建议,请查阅我们的cDNA 测序入门指南
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了解使用全长纳米孔 RNA 测序进行基因表达分析和选择性剪接分析的更多优势。
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人类转录组的剪接变异分析

使用直接 cDNA 测序试剂盒进行文库制备,接着在 PromethION 设备上进行测序,每张测序芯片可生成 1500 万至 3000 万条读长,适用于对剪接变异进行全转录组分析。可使用无扩增条形码扩展包实现样本混样建库。
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有较低的样本起始量,测序较小的转录组,或进行靶向分析?

检查 cDNA-PCR 测序试剂盒和 MinION 测序平台。

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