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单核苷酸变异和定相

单核苷酸变异 (SNV) 与表型变异及疾病的相关性已得到了广泛研究，它们也被用于对单倍型进行定相（phasing）。然而，传统测序技术对 PCR 的需求使得 SNV 检测仅限于扩增区域，并且短读长也令解析单倍型分型具有挑战。在使用长读长纳米孔测序时，无需进行 PCR，使其能够揭示其他技术无法探及的区域中的单核苷酸多态性（SNP），并大幅简化定相。

介绍

通过长序列读长加强变异识别和定相（phasing）

使用基于阵列的技术和短读长测序分析 SNV 后发现，SNV 和复杂疾病遗传之间存在关联。然而，这些技术生成的数据仅在运行完成后方可使用，这使得在一些速度极为关键的情况下（例如疾病暴发调查、法医分析和临床研究）无法进行及时响应。 Oxford Nanopore 技术的实时测序和分析，加快了从拿到样品到确定基因型的时间，从而实现立即响应。该技术同时具备可扩展性：可使用 GridION 和 PromethION 在较大型基因组或混样样本中进行高通量变异识别；便携式 MinION 适用于较小型基因组的变异识别，以及在实验室和现场进行靶向检测。将变体匹配回母源或父源染色体，对于了解新生（de novo）突变的遗传模式、嵌合和亲本来源等至关重要。例如，想要直接解析两种杂合单核苷酸多态性（SNP）的单倍型，它们两者都需要存在于相同的测序读长中。这对短测序读长具有本质的挑战。Nanopore 长读长可提供序列的背景信息，并加强变体定相（图 1）。

Phasing single nucleotide polymorphisms — 图1：与使用短读长测序或基于阵列的数据进行的定相比较，通过长纳米孔测序读长可加强对 SNV 的定相，这是由于变体位于同一读长序列中的可能性更大。

Latest SNV Indel metrics — 表1：小型变体识别的最新精度值（precision），查全率（recall）和 F1 值（精度和查全率的谐波均值）；使用人类基因组 20 号染色体（NA24385; HG002），60X 的纳米孔测序数据覆盖深度。同时展示用于实现类似指标的推荐分析工具链。使用 GIAB 的高置信度识别集作为真值集。有关更多信息，请参见 GitHub 变体识别页面。

纳米孔测序能够以高精度和查全率实现基因组范围的变体识别

传统用于识别 SNV 的短读长方法需进行 PCR，从而可能引入偏好性，阻碍对不宜扩增的基因组区域的研究。借助 Oxford Nanopore 的技术，则可以对天然 DNA 链进行测序，无需进行 PCR。这不仅扩大了 SNV 识别的基因组覆盖范围，还可以在同一测序中常规访问甲基化信息。从纳米孔序列数据中，可获得高精度和查全率的基因组变体。表 1 显示了来自 Oxford Nanopore 的最新人类基因组 SNP 和插入缺失（indel）基准指标，以及达到类似数值的推荐工具。开发和优化变体识别工具是我们研究中一个非常活跃的领域。用于 SNP 识别的不同生物信息学工具呈现不同的性能差异，因此，达到最佳的灵敏度和特异性，优化分析工作流程的过滤参数十分重要。

研究案例

使用纳米孔长读长测序对 GBA 基因突变进行识别和定相

"除引起疾病的变体以外，[MinION] 还可以检测内含子变体，并提供定相信息。因此，与其他测序技术相比，MinION 方案可以提供 GBA 基因更进一步的信息......"
Leija-Salazar 等人

GBA 基因编码溶酶体酶葡糖脑苷脂酶，当该基因的突变为双等位基因突变时，会导致戈谢病，并与帕金森病高度相关。邻近的假基因 GBAP 有 96% 的外显子序列与 GBA 编码区域一致，不正确的定位使得利用短读长测序分析该基因具有挑战性。

在 102 名个体中，Leija-Salazar 等人评估了 MinION 长读长测序生成的一个长为 8.9 kb 跨越 GBA 基因的扩增子。所有已知的错义突变均被检出，包括常见的 p.N409S (N370S) 和 p.L483P (L444P) 突变和其他罕见变异。该团队还成功对突变进行了定相。所有罕见的假阳性 SNV 均被轻易识别出并过滤。

研究人员认为，100X 的覆盖深度即可检测所有变异，过滤后没有出现假阳性。尽管他们认为较低的覆盖深度（约 50X）也可能足够。

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