准确率
最近更新时间：2021年5月
多年来，Oxford Nanopore 不断通过技术迭代来提高性能。我们通过更新分析方法和新的化学试剂来持续改进纳米孔传感系统。本页面将带领您了解您可以从纳米孔测序系统中获得什么，以及选择哪些工具来实现这些结果。
介绍
纳米孔 DNA 与 RNA 测序的准确率可以用多种方式来测量，科学家所用的相关指标将取决于其开展的具体实验。
与所有系统一样，为您感兴趣的分析选择最新的分析工具至关重要，样本的质量也会影响结果。由于有如此多的相关变量，清晰的指南就变得非常重要。下面我们定义了一些准确度的测量类型，并包括了针对获得最佳性能的推荐。
原始读长准确率
纳米孔测序提供对目标分子的直接电子分析，而非对合成拷贝进行测序，或使用类似荧光的替代标记。碱基识别算法被随后用来解读生产的测序读长序列。纳米孔碱基识别算法随时间不断提升以增强准确率，同时新的方法也可以被应用于既往已测序过的原始数据。
直接测序避免了诸如 PCR 带来的偏好性来源，并提供目标分子的原始信息。我们将原始读长准确度定义为一次读取单个 DNA 或 RNA 片段/分子所达到的准确度。与原始读长测序相关的应用包括了时间关键型应用，但目前大多数应用更倾向于关注变异识别、共有序列准确度或其他指标。原始读长准确度的提高可以推动其他准确度指标的提高。
| 化学试剂 | 原始读长准确率（众数值） | 分析工具 | 样本 |
|---|---|---|---|
| R9.4.1 | 98.3% | MinKNOW 4.3 软件（“超精度”碱基识别模式）；Guppy 5 | 混合基因组 |
| R10.3 | 97.5% | MinKNOW 4.3 软件（“超精度”碱基识别模式）；Guppy 5 | 混合基因组 |
| “Q20+" | >99.3% (众数) | 研究版算法 Bonito | 多种（该试剂处于早期试用阶段） |
| 化学试剂 | 共有序列准确率 | 分析工具 | 样本 |
|---|---|---|---|
| R9.4.1 | ~100X 深度 Q50 | Guppy 碱基识别, Flye 组装, Medaka 矫正 | Zymo 模拟群落（细菌） |
| R10.3 | ~50X 深度 Q50 | Guppy 碱基识别, Flye 组装, Medaka 矫正 | Zymo 模拟群落（细菌） |
| R10.3 | ~60X深度 Q47，N50 ~80 Mb | Guppy 碱基识别, Flye 组装, Medaka 矫正(人类特异性模式) | 人类，HG002, 第 20 号染色体 |
共有序列准确率
单分子共有序列准确率
通过将单个原始片段或分子的多个完全相同的拷贝结合成单个高质量序列，共有序列生成也可应用于特定的兴趣区域。这些完全相同的拷贝可以在单条读长序列中一起测序，例如通过滚环或线性扩增生成，或者可以通过使用“唯一分子标识符”（UMI）联系起来。通过将多个拷贝结合在一起，可以提高准确性。
在包括液体活检低频变异检测或 16S 测序的应用领域中，单分子共有序列可能尤其有益。
| 化学试剂 | 单分子共有序列准确度 | 分析工具 | 样本 |
|---|---|---|---|
| R9.4.1 | ~99.995%, Q45 | UMI | rRNA扩增子（25X） |
| R10.3 | 99.995%, Q45 | UMI | rRNA扩增子（15X） |
覆盖所有基因组
要想创建准确的基因组图谱，测序技术能够覆盖基因组的所有部分，甚至是难以定位的部分非常重要。重复性和低复杂性区域遍布基因组，而这些区域很难用传统技术进行测序和比对。例如，据估计，短读长技术只能覆盖人类基因组的92%，剩下的包含许多疾病相关基因的 8% 部分却未能包含在数据集合中。纳米孔技术已被证明可以将基因组中的这些“暗区“减少81%，揭示出基因组中未曾被任何其他技术测序过的部分（Ebbert，2019），呈现一个更完整的图像。
变异识别
单核苷酸变异（SNV)，小型插入缺失以及结构变异（SV）对于理解基因组变化对表型的影响非常关键。纳米孔技术能够对任何长度的核酸分子进行测序，这使得对复杂结构变异的解析达到了前所未有水平，也使得识别单核苷酸改变和单倍型定相（phasing）成为可能。
识别变异的准确能力通常由查准率（precision）和查全率（recall）来表示，这些数值是通过多次覆盖感兴趣位置的读长序列中得到的。查准率（precision）是指在一个识别的集合中，正确识别所占的比例；而查全率（recall）是能够在识别集合中找到的变体所占基因组中存在的变体的百分比。
纳米孔化学试剂的最新查准率（precision）和查全率（recall）和F1值（查准率和查全率的调和平均数）可以在下面找到，同时附带实现类似指标的推荐工具链接。
最近的纳米孔测序技术更新可获得：
| 化学试剂 | 覆盖度 | 查准率（Precision） | 查全率（Recall） | F1 值 | 工具 | 样本 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 结构变异（SV） | R9.4.1 | 50X | 97.5 | 95.5 | 96.49 | EPI2ME 工作流, github 流程, EPI2ME Labs 教程 | 人类, HG002 |
| R10.3 | 60X | 95.6 | 96.4 | 96 | EPI2ME 工作流, github 流程, EPI2ME Labs 教程 | 人类, HG002 | |
| 单核苷酸多态性（SNP） | R9.4.1 | 50X | 99.2 | 99.2 | 99.2 | Medaka, EPI2ME Labs 教程 | 人类, HG002 |
| R10.3 | 60X | 99.2 | 99.2 | 99.2 | Medaka, EPI2ME Labs 教程 | 人类, HG002 |
碱基修饰
四种“经典”碱基（DNA中 的 A、C、G 和 T；RNA 中的 A、C、G 和 U）可以通过加入额外的化学基团——如甲基化，进行生物修饰。这些修饰可以显著改变基因的表达，且与包括癌症在内的一系列疾病有关。科学家们对新发现的表观遗传变化会如何影响功能变化的了解尚仅触及表面，例如，已知 RNA 拥有 170 多种截然不同的修饰。
Oxford Nanopore 的技术可以直接对 DNA 或 RNA 分子进行测序，能够直接、实时检测 5mC、5hmeC、6mA。
这使得这些碱基修饰在不需要额外实验或样本制备步骤的情况下就可以被检测，并且修饰信息可通过已随仪器装载的软件获得。相比之下，传统技术可能需要单独的叫作亚硫酸氢盐测序的一个过程，这个过程不仅需要对样本进行粗暴的处理，并存在许多局限性。
最近发表的论文显示，纳米孔修饰检测和现有技术之间具有极好的相关性，并检测到了一些以前替代方法未能检测出的其他修饰位点。
了解更多 ”表观遗传应用“。
查看”基准性测试数据“
| 与全基因组重亚硫酸盐测序相比，纳米孔测序具有以下优势 |
|---|
| 相关性更强 |
| 能够识别更多的 CpG 位点 |
| 所需的数据更少 |
| 分析速度更快 |
| 工作流程更简单，且实验操作无毒 |
| 更好的重复性和一致性 |
| 能够实现甲基化定相（phasing） |
| 覆盖度更均匀，更小的 GC 偏好性影响 |
检测准确度
测序可用于进行特定的生物学检测，例如某一特定生物体的存在与否、物种鉴定、检测一种或多种遗传变异，或在一次分析测试中进行多组学检测。测试准确度可以定义为这项技术每次都能找到正确答案的能力，这可以通过确定所以案例中真假阳性和阴性的比例来量化。在食品安全和微生物监测等领域，检测测试准确度是一个重要的指标。纳米孔测序已被证明在准确进行不同类型的检测方面的有效性。您可以在资源中心浏览更多案例。
这些示例的分析流程针特定于所涉及的测试，推荐的工具可在实验方案生成器（Protocol Builder）中获得。
2020 年，英国政府发布的一项23000个样本的研究显示 Oxford Nanopore 首个通过监管的监测准确性达金标准。阅读研究
未来发展
我们的目标是使任何人、在任何地点、都能对任何生物进行基因分析，因此我们一直在追求持续的迭代性能改进。多年来，Oxford Nanopore不断更迭技术以提高其性能。我们将继续改进纳米孔传感系统，通过更新分析方法和新的化学试剂提高准确度。最新发布可在纳米孔社区（Nanopore Community）或新闻资讯版块中找到。