应用方向 调查方向
融合转录本
准确鉴定融合转录本对疾病（包括某些类型的癌症）的临床研究十分重要。但通过传统短读长测序方法进行识别时，需要以小片段形式对转录本进行测序，然后再进行计算组装，从而可能导致多重定位和错误组装。使用长读长纳米孔测序时，可以在单个读长中对融合转录本进行端对端测序，从而对融合及其精确的剪接连接进行综合鉴定。
使用纳米孔长读长测序全长融合转录本
通过简单、灵活的工作流程标靶融合转录本，含 PCR 或无需 PCR
通过实时测序和分析快速识别融合
介绍
融合转录本的全长测序
融合转录本是融合基因的产物或是由不同基因编码的转录本的拼接，因其与许多疾病（包括某些癌症）相关而在临床研究中具有显著性。采用传统 RNA 测序方法的转录本测序需要对 cDNA 测序文库进行片段化，并以约 50-100 个碱基的读长中进行测序；随后通过对读长进行计算组装来推导出完整的转录本序列。但是，这些短读长序列可能会使融合的精确断裂点定位变得困难，并可能导致错误组装的转录本和高水平的多重定位（图 1），从而无法将读长序列匹配到单个转录本。此外，对 PCR 的要求意味着难以扩增的转录本可能无法得到充分描述或无法从测序数据中获得。采用纳米孔测序时，没有读长上限，且无需片段化，可在单个长读长中对转录本进行端到端测序，从而能够明确识别融合转录本。
图 1：与短读长测序技术相比，长读长纳米孔 cDNA 测序大幅减少了多重定位率。可对融合转录本进行端到端测序，从而准确、明确的对其进行检测。
图2：定性和准确的定量数据均可通过 PCR-cDNA、直接 cDNA 和直接 RNA 纳米孔测序生成：在此图中，通过这些方法各自对 RNA spike-in 进行测序时，观察到的和预计的计数之间可见良好的一致性。从而实现在一个实验中进行异构体鉴别和计数。
使用多样化的 RNA 和 cDNA 测序方法，定制满足您实验目标的工作流程
您可以通过多样化文库制备和测序选择，定制纳米孔工作流程来满足您的需求。Oxford Nanopore 开发了直接 RNA 测序——这是唯一的一种能够使对天然 RNA 分子进行直接测序的方法，消除了 PCR 偏好性，可同步识别碱基修饰和核苷酸序列。直接 cDNA 测序也无需 PCR，可为需要更大覆盖范围的应用提供更高的通量；同时，经过优化的 PCR-cDNA 测序，可以极低的 PCR 偏好实现最高的通量。每种方法均提供定量和定性数据（图 2）：可以从单个数据集中可靠地检测和计数融合转录本。通过使用便携式、有成本效益的 MinION 或 Flongle、灵活的 GridION 上进行实时测序和分析，实现快速的周转时间；或者通过功能强大的 PromethION 来扩展规模，实现产出最大化。还可以根据需要对样品进行混样建库测序来分批处理样品，从而进一步降低每个样品的成本。
使用半特异性 RT-PCR 富集和鉴定融合转录本
在一些情况下，融合转录本可以由一种或几种易位事件产生的融合基因生成。两个基因的身份可能是未知，这意味着无法通过设计引物来标靶转录物的两端。 在这里，可以使用半特异性 RT-PCR 来富集融合伴侣未知的融合转录本（图 3）。 首先，通过 VN 引物对文库中的总 RNA 进行反转录，该引物可与任何加有poly (A) 尾的 RNA 杂交，并带有引物位点以进行后续扩增。 接下来进行半特异性 PCR ，使用一种与加尾的 cDNA 分子互补的引物，以及一种靶向已知转录本末端的引物来对转录本进行扩增。 这样，可以以高覆盖深度富集全长野生型和融合转录本，并对其进行测序，从而能够准确检测融合。
Figure 3: Semi-specific RT-PCR and long-read nanopore sequencing enables detection of full-length fusion transcripts where only one end of the fusion is known. The q12 region of human chromosome 22 can be involved in several different translocation events (a). In each, a fusion gene is formed; these lead to different types of cancer. Semi-specific RT-PCR was used to reverse-transcribe RNA from a clinical research sample of a known translocation affecting the EWSR1 gene (b). Sequencing of the enriched amplicons enabled precise breakpoint identification and identification of the fusion partner (c).
研究案例
使用 cDNA 测序快速识别致癌基因融合
“Nanopore 测序完全符合临床融合检测的需求。”William Jeck，2018 年纳米孔社区科研团体大会
对于由基因融合引起的疾病，例如急性早幼粒细胞白血病，治疗的时间通常至关重要。但是，通过传统方法识别这些融合可能需要一周或更长时间的周转时间。在 2018 年 Nanopore 社区会议上的演讲中，William Jeck 描述了他和团队如何使用 nanopore cDNA 测序技术开发一种从临床研究样本中快速检测致癌基因融合的方法。该方法使用锚定多重 PCR（AMP）生成目标 cDNA 文库。然后在 MinION 上对这些序列进行混样建库测序。该流程最先用于成功鉴定红白血病细胞系中的 BCR-ABL1 融合蛋白，并且在开始运行后的数秒内就产生了第一个融合读长序列。长读长可以分辨融合过程中远距离外显子结构。在一份白血病样本中发现 PML-RARA 融合，并通过在 Flongle 测序芯片上进行测序成功识别出 ELBR-FLI1 基因融合，证明了其作为具有成本效益的融合检测工具的未来潜力。
工作流程
我该如何使用纳米孔测序检测融合转录本？
融合转录物的富集可以通过使用序列特异性（已知转录物的两端）或半特异性（已知转录物的一端）的 RT-PCR 进行。 使用 PCR-cDNA 测序试剂盒制备文库，然后在一个 MinION 测序芯片上测序，可提供约 1800 万条 cDNA 读长，覆盖深度很高。 在较小的 Flongle 测序芯片上，测序规模可进一步缩小，实现经济高效的长读测序。MinION 测序仪和 GridION 测序仪均与 MinION 和 Flongle 测序芯片相兼容；便携式 MinION 设备非常适合在采样点进行测序，而 GridION 可以在多达 5 个可单独寻址的测序芯片上测序，以进行灵活的按需分析。 Oxford Nanopore 和纳米孔社区均提供许多强大的工具来分析全长纳米孔 RNA 测序读长。请访问纳米孔社区的“生物信息学”部分以获取数据分析教程。
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使用长读长纳米孔测序检测临床研究样本中的融合转录本
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