Nanopore Tech Tour: 上海场精彩回顾

昨天，Nanopore Tech Tour 登陆上海开始又一天精彩的嘉宾演讲，现场测序演示，教学专场和测序芯片上样实践。欢迎大家继续阅读了解大会内容摘要。

Chun Hang Au博士，香港养和医院，中国

"无需qPCR等仪器设备，MinION可以直接完成测序，我强烈推荐分子诊断学家们开始考虑使用实时的MinION测序仪。"

Chun Hang Au博士在演讲开始时表示，结构变异（SV）检测是血液恶性肿瘤中综合分子谱分析的关键组成部分。当前的主流检测技术包括核型分析、RT-PCR、荧光原位杂交（FISH）和NGS等，基于纳米孔测序长读长，快速实时的特点，2017年以来，他及团队一直在评估纳米孔测序在诊断分子病理学实验室环境中的临床应用。

在一名患有急性髓性白血病（AML）的成年患者中，他利用MinION进行全基因组测序，检测到了隐蔽驱动易位(cryptic driver translocation) t(5; 11) 和乘客易位(passenger translocation) t(10; 12) 的确切断点。在患有T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的成年患者中，纳米孔全基因组测序检测了到易位的精确断点t（11; 14），并揭示了潜在的TRA / TRD-LMO2融合。断点信息不仅为患者提供了重要的诊断和预后信息，而且还为治疗监测提供了疾病特异性标记。他们还将纳米孔WGS用于非整倍性筛选，以及使用CRISPR / Cas9介导的靶向纳米孔测序进行的特定SV断点检测，在不到1小时便获得靶向测序结果。

最后，Chun Hang Au博士总结到，MinION可以很好的结合短读长测序技术、数字PCR等传统技术完善血液病等遗传病学的临床应用，并且有低成本、方便携带、文库制备简单和常规的生物信息学分析流程等优势，并强烈推荐分子诊断学家们开始考虑使用实时的MinION测序仪。

肖传乐副研究员，中山大学，中国

肖传乐副研究员来自于中国中山大学, 他在演讲开始时提到，纳米孔测序技术具有读长长，无PCR扩增偏好性和碱基修饰敏感性等特点，在动植物的基因组从头组装和表观遗传检测研究中具有明显的优势，已成为三代测序主流技术。他主要分享了他及团队开发的三代测序关键计算方法及应用：

在基因组组装方面，肖传乐副研究员的团队提出了一种名为global seed voting scoring model的打分模型和局部序列校正模型（partial map sequence correction model），开发了一种快速的组装系统 NECAT。结果显示NECAT在人数据集的组装速度是同类软件（Canu和FALCON）17-56倍，该研究成果于2017年发表在Nature Methods期刊，目前NECAT已组装了20余个中国特色植物基因组。

2. Nanopore表观遗传学修饰检测方法

使用深度循环神经网络（RNN）模型，他开发了可用于精确识别纳米孔测序数据中表观修饰的软件DeepMod，实现了高精度全基因组单碱基水平检测5mC和6mA，检测平均精度可分别高达99%（5mC）和90%（6mA），该成果于2019年发表在Nature Communications (DOI: 10.1038/s41467-019-10168-2) 杂志上。

汪德鹏 CEO，希望组

希望组CEO汪德鹏先生在演讲开始时首先提到，在他们早期利用短读长测序技术进行的人类基因组项目（如炎黄1号）中，尽管取得了很多成果，但受到技术本身限制而难以解析重复序列区。他们随后启动了HX001项目，来检测人类基因组的结构变异，并开发了相应的NextDenovo和NextPolish基因组组装算法的工作流程。结合纳米孔测序PromethION平台的超长读长数据，对水稻9311进行组装测试，水稻有12条染色体，组装结果几乎达到了单contig一条染色体的水平，Contig N50 高达23.6Mb。they were able to sequence and assemble the 12-chromosome Oryza sativa (rice) “9311” genome to almost whole-chromosome contig level, with a contig N50 reaching 23.6 Mb.

接着，汪德鹏先生说到，在目前基因组疾病研究中，有很多结构变异无法利用短读长技术获得。而利用纳米孔测序能够全面地检测这些突变，从从结构变异到单碱基突变，插入、删除、拷贝数变异、短串联重复以及甲基化，获得完善的变异图谱。

继华夏一号、华夏2号和华夏万人SV计划之后，希望组推出了基于PromethION平台的中国人全基因组结构变异dbSV计划，构建一个庞大的结构变异数据库。汪德鹏先生强调了PromethION测序的高通量，可以在短时间内生成非常大的数据集，并指出通量可以大大高于替代的高通量第三代测序技术。

dbSV项目有三个阶段，第一阶段已经完成了基于1424人的全基因组测序突变数据库，得到每次运行平均50G数据量，平均读长17k，平均N50 22k——足够测序深度18x的基因组覆盖度。通过测序数据，他们能够对删除、重复区域、插入和倒位等多种结构变异进行解析。目前该项目正处于第二阶段，汪德鹏先生表示，接下来希望组将继续完成更多基于纳米孔测序平台dbSV数据库，并希望更多的人参与到这个项目中。

杨林峰总监，华大科技，中国

作为一家在动植物基因组测序和组装方面经验丰富的领先服务提供商，华大基因目前已经完成了很多基因组项目，并与合作者共发表了165篇研究文章。杨林峰总监说到，仅使用传统的短读测序技术会产生高度碎片化的组装，尤其是在较大基因组组装中，限制了它们作为参考序列的用途。为了解析复杂的基因组，则需要更长的读长序列，这也意味着纳米孔长读长技术具有巨大的潜力生成高质量读长解析复杂基因组。

他及团队利用3种植物和2种动物样本评估纳米孔数据的质量，结果表明，样品的Q值平均分布无偏倚，80%读长的平均Q高于10。接着对Transducer和Flip-flop HAC模式进行了基准测试，使用最新版本的Guppy可以减少4%的错误率，Flip-flop HAC可以进一步减少2%的错误率。他建议使用Guppy和Flipflop HAC模式来获得更精确的纳米孔数据。接着他展示了5种不同的植物和5种不同的动物的复杂基因组组装，证明纳米孔测序能够实现高度重复的动植物基因组的超长连续N50。对一个高度杂合子（1.4%）植物基因组研究，最终组装数据：基因组大小633Mb，覆盖度120x，Contig N50为3.6Mb，Busco得分为92.4%

为了评估纳米孔测序是否能够满足BGI的需求，杨林峰及团队分别对5种动植物进行了测序，获得的数据中80％的原始Q值大于10。为进一步探究数据质量，杨林峰总监随后研究了不同的碱基识别选项，对数据使用transducer和“flip flop”碱基识别并进行比较。 在展示了一些初步的结果后，杨林峰总监表示，使用最新版本的Guppy软件可以将每条读长序列的错误率降低4％，而切换到Guppy高精度模式可以将错误率再降低2％，从而实现更好的组装。可以将这些发现转发给将来的项目以提出建议，包括在下游分析之前更新为最新的碱基检出方案。这些发现可对未来的项目开展有很好的建议作用，其中包括在下游分析之前更新到最新的碱基识别方案。

杨总监还分享了纳米孔测提高动植物基因组组装的案例，其中一些显示出了高度的重复，这使得它们在过去很难进行研究。在这里，他们旨在生成具有高contig N50的组装，以提供比现有基因组草图更完整的组装。在一个基因组大小为633 Mb的例子中，尽管该植物表现出极高的杂合性，120x测序深度的覆盖度仍提供了3.6 Mb的congtig N50 和92.4的BUSCO完整性评分。

在另外两个案例中，杨林峰总监描述了加入纳米孔测序数据后如何极大地改善了高度重复的植物基因组，其中重复含量可达71% – 74％，并证明使用Medaka和Racon进行错误校正，然后使用NECAT进行组装可作为这些复杂基因组组装有效而准确的流程。

杨总监在总结时说: “在从头组装时，纳米孔读长优于短读长，这是因为纳米孔测序具有长读长、低偏倚和高一致性、足够的测序深度等优势。因此，组合方法可用于优化组装。”