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NCM 2020大会发布：99.1％单序列准确度，PromethION 测序 10Tb 数据新记录
03 December 2020
在 2020 年 Nanopore 科研团体大会的更新中，Oxford Nanopore 展示了多项关键的测序技术进展。包括使用迭代改进的 PromethION 测序芯片，实现 10 Terabase 数据的最新测序记录，使用当前正开发的新测序化学试剂法获得 99.1％ 单序列众数准确度，高准确度变异识别工具以及可用于任何规模纳米孔测序实验的自动化选项。
纳米孔测序设备的多功能、可联网、带触摸屏的便携式一体机 MinION Mk1C，台式 GridION 和高通量设备 PromethION 均含有内置计算功能，意味着任何人都能够获得和使用我们的测序技术，无论其项目规模大小。
进一步提高准确度
Oxford Nanopore 近期发布了一款名为 Bonito CRF 的新算法，可提高对单条读长序列识别（在 DNA 单分子上确定碱基序列过程）的准确性。此次 Bonito 更新立足于先前的工作基础，性能上更有提升，且接受了来自更多、更多样化的数据训练集。使用 BonitoCRF，Oxford Nanopore 利用当前化学试剂方法呈现了 98.3％ 的单序列读长准确度，且有来自 Nanopore 用户单序列读长准确度 >98％ 的报告。
高单序列准确度可支持获得非常高的共有序列准确度（分子被多次测序）。使用优化后的 Guppy/Bonito 碱基识别分析工具，用 Canu/Flye 组装以及 Medaka 矫正，现使用 R9.4.1 版测序芯片可达 Q45，使用 R10.3 版测序芯片可达 Q50。
变体识别的性能也随新版本发布不断提升，在30X的覆盖度下，结构变异（SV）的准确率已可达 96％ 的金标准，而非需要 60X 覆盖度。SNP 准确度现为 99.92％，与短读长准确度相当。
此外，使用一种新的化学方法，Oxford Nanopore 本周在 Bonito 算法上生成了 99.1％（99％= Q20）原始序列众数准确度，并通过内部验证数据集进行了验证，其中大部分原始读长序列高于 Q20。
最新产量纪录
11月，Oxford Nanopore 开始发送在产量和稳定性上经过迭代改进的 PromethION 测序芯片。这些改进也使得在一个内部测序运行中，使用全部 48 张芯片的单次 PromethION 运行创下 10 Tb 人类基因组数产量的新高，较此前记录提高了 25％。在此次运行中，每张测序芯片产量的中位数为 208Gb，相当于 30x 覆盖度下的两个人类基因组。这些改进也反映在了各个应用中，来自用户报告的产量均有所提高。
PromethION 平台预计将随在未来几周内即将发布 R10.3 版 PromethION 测序芯片有进一步的提升。
在使用 PromethION 进行的高通量项目或群体规模的大型项目中，不同工作流程的搭配选择均可为任何体量的数据提供高价值、且成本极具竞争力的基因组。
对跨越大型或复杂的结构变异、重复区域以及解析难以组装的困难基因组区域，使用长读长序列更为理想。对于那些对获得 >100kb 序列片段感兴趣的研究者，我们即将发布一款经过优化的新超长DNA测序试剂盒。在内部测试中，我们在一张 PromethION 芯片上能够生成 90-100Gb（读长序列 N50>100kb），并且收获单条读长 4.15Mb 的最新记录。
大规模自动化样品制备
随着在生产规模环境中使用纳米孔测序的用户数量不断增加，Oxford Nanopore 在 2020 年期间一直专注于自动化的解决方案，方便用户运行大批量样品、操作更大型的项目，或实现日常工作流程的自动化。
Oxford Nanopore 与全球先进的制造商 Hamilton 公司合作，结合专业知识在其DNA文库制备实验室工作站 —— NGS STAR 96 上实现文库制备工作流程的自动化。合作发布的首个实验方案只需 5 个小时即可制备 96 个样品，其中手动时间仅为 1 小时。一次自动化制备可满载两台PromethION 48 测序仪，实现经过高度验证的样品制备和高产量测序。
Oxford Nanopore 还与 Opentrons 公司合作，为 MinION 或 GridION 设备用户提供适用的中型实验室自动化方案。Opentrons 的自动化液体处理机易于使用，结构紧凑，每天可支持 2500 份 LamPORE 快速新冠检测，可以用于连接测序试剂盒或 ARTIC 无扩增分子条码方法（新冠病毒基因组测序）的自动化，同样也适用于未来基于 PCR 扩增的应用。
在小规模方面，VolTRAX 自动制备仪也在今年取得了众多进展，包括开发了可进行 PCR 的耗材管设计，将与现有的测序和混样建库试剂盒一起推出。
演讲中的其他更新
准确性
- 2020 年初，针对提高均聚物分辨率、改善甲基化分析的 R10.3 版纳米孔测序芯片在 MinION 和 GridION 设备上发布。可与高通量 PromethION 设备兼容、或在 Flongle 上进行快速、低成本测序的 R10.3 芯片也将很快上市。
- 数据集：为支持用户更好地了解最新的纳米孔工具和测序数据，Oxford Nanopore 发布了人类基因组数据集 HG002，展示纳米孔测序平台的最新性能。该数据集将随新算法、工具和化学方法的开发定期更新。
信息丰富的数据
- 表观遗传学：经过不断的创新来提升测序过程中鉴定甲基化碱基的能力，纳米孔测序现与全基因组亚硫酸氢盐测序结果具有很强的相关性，即使在约 20x 的低序列深度下也是如此。纳米孔测序分析提供更多的甲基化位点数量，较亚硫酸氢盐测序呈现出更佳的再现性。此外，分析可作为常规纳米孔测序过程的一部分使用，无需额外的样品制备或成本。
- 测序长序列片段：Oxford Nanopore 设备持续实现对任何长度的 DNA/RNA 片段（短片段到超长片段）的直接测序。当前测序的最长序列片段记录为 4.2 Mb。对更长的片段进行测序可提供有关结构变异的丰富数据，这些变异在人类基因组中占据的碱基对数量差异最大，并导致多种人类疾病。
靶向测序
- 在 GridION 设备上发布的“适应性采样“（Adaptive Samplaing）的功能实现了实时、智能的靶向富集，无需预先制备样品。用户通过对测序控制软件 MinKNOW 进行编程来靶向特定的目标区域。然后，纳米孔测序通过‘’接受‘’目标 DNA 序列，”拒绝“来自非靶标片段的序列，实时富集感兴趣的相关区域。这种方法同时保留了读长序列长度和甲基化信息，以便进行丰富的信息挖掘。
- 最近针对靶向纳米孔测序推出的 Cas9 测序试剂盒，可对此前无法触及的目标区域进行高深度测序，捕获长达 100 kb 的序列长度，并保留甲基化信息。