翘望2019 | 回首纳米孔测序的那18件事

1.《自然·方法》杂志发布里程碑式的直接RNA测序文章 1月，《自然·方法》杂志封面着重介绍了首个直接 RNA 测序的文章: “Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores”。该里程碑式的发表无需进行逆转录或扩增步骤，允许生成全长、链特异性的 RNA 序列，修饰信息被完整的保留。世界各地的许多实验室正在积极探索直接 RNA 测序。一篇在 11 月发表的文章中，研究者们使用纳米孔原始 RNA 测序人类 poly(A) 转录组，甚至在宇宙国际空间站使用 MinION 测序 RNA。

1 月,《自然·生物科技》杂志发表了使用纳米孔技术组装——迄今为止使用单一技术完成的最完整的人类基因组组装。来自 9 个不同研究机构的研究者联盟，在他们的组装中加入了超长读长来加倍组装的连续性，预估端粒长度，解析包括 4Mb 的大型组织相容性复合体在内的复杂区域。

 2017 年第一个发表的纳米孔人类基因组，使用了 MinION 测序仪以及许多的测序芯片来完成。如今，相同的 91.2Gb 只需几张 MinION 芯片，甚至只要一张 PromethION 芯片就能获得。

3 月，在尼日利亚发生了意外激增的拉萨热感染数量，MinION 被用于实施动态实时的基因组监测。研究团队利用基因组产生的见解，探明这次的感染激增是源于一个现存的毒株，而非新型病毒，为公共卫生响应提供了信息。

这也为今年看到的公共卫生团队使用纳米孔技术研究狂犬病、拉萨热、黄热病、流感、登革热、疟疾、大肠杆菌、MRSA 等又增加了经验值。

在这个领域中，转移运输样本不是理想选择，并且耗费宝贵的时间。对于便携式 MinION 在这个领域正在产生的影响，我们感到无比自豪。我们还对它在未来对更多人可能产生的影响感到兴奋。例如，ARTIC network 正和许多国家的合作者工作，开发具有实践意义和有效的方法，使用实时、便携式的 DNA/RNA 测序来了解疾病爆发，以及改善被这些疾病感染的人们的预后。

5 月，诺丁汉大学的科学家 Matt Loose 夺下桂冠，获得史上最长的被连续测序的 DNA 片段，长度约 2.3Mb。对此，BBC 在报道时幽默的表示，这不仅是科学上的胜利，还是一个友好的科学角逐赛：“这个研究开启了在单条读长测序整条染色体的大师杯赛”。

5. PromenthION 测序仪投放市场：长读长、直接测序现在能够针对大型基因组和大型测序项目应用

5 月: 自 2017 年末以来，PromethION 在我们内部实验室和早期试用者的使用性能一直在攀升。在 5 月，PromethION 的性能演变已经可以使我们从单张芯片中得到多达 100Gb 的 DNA 测序数据。若使用 48 张芯片的话，则意味着 Tb 级的数据输出。因此，我们决定将它商业化投放市场。

 正如大家所知，我们想要颠覆测序技术的可得性，因此我们将 PromethION 变得伸手可及。你可以选择无需支付设备本身的资本支出，测序芯片最低支出为 625 美元。使得低成本的大型纳米孔基因组成为可能，并且可得。

在 2018 年末到来之前，PromethION 取得了更大的前进。纳米孔社区的科学家已经在单张测序芯片获得 148Gb 的测序数据，在我们自己的内部测试中已获得 220Gb。然而，每张芯片的价格和无设备资本投资，并没有因为性能的持续的提升而发生改变。这一年中，PromethION被越来越多的用于高影响力的项目中，包括种群规模的基因组研究，以及植物和人类基因组。

在 10 月，生物巨头安进公司指出，冰岛著名的基因解码（deCODE Genetics）公司已经使用纳米孔技术测序了数百个人类基因组。在人类遗传学大会上，来自 VIB 的团队公布了首个使用PromethION 进行的一个人类全基因组测序，证明大型、可负担起的长读长测序已经到来。

6. 新版 “Rev D”测序芯片，开始提供每张 MinION/GridION 芯片多达 30Gb 测序数据 模式纳米孔测序使我们能够通过升级包括纳米孔、算法和化学试剂等在内的各种不同元素来持续的改进和提升系统。我们相信，不断地取得更多、更好的数据能帮助研究者们探索生物学的新领域，以及改善每个 Gb 数据的价格。在 6 月，我们发布了一部分“Rev D”版测序芯片，延长了 MinION 和 GridION 芯片的寿命，使它们可以交付多达30Gb数据。十月，这些芯片成为了 MinION 和 GridION 的默认发货芯片。 7. 基于纳米孔的人类 Y 染色体组装 在 6 月，Kuderna 等人发表了一篇名为 "Selective single molecule sequencing and assembly of a human Y chromosome of African origin" 的文章，展示了高度连续和完整的非洲起源的首个人类Y染色体组装。

文章通过使用一个新型的策略，在 MinION 测序仪上对原始的、未经扩增、流式细胞仪分选的DNA测序。与以前的方法相比，研究小组取得了显著的提升，将连续性提高了 800％ 以上。最为重要的是，这种方法适用于任何物种，简化了对极端大型和重复基因组的组装。

 同样与 Y 染色体相关的是，在 3 月份，由加州大学圣克鲁兹分校的 Karen Miga 博士领导的一项关注 Y 染色体着丝粒的研究发表在了《自然·生物科技》杂志上。这项工作证明使用纳米孔技术交付的首个完整和准确的人类着丝粒序列。人类着丝粒由大量近似相同的串联重复组成，使得它们难以使用短读序列技术进行组装。利用纳米孔技术产生的长读长，该团队对 8 个 BAC 克隆进行了测序，这些克隆共同跨越Y染色体着丝粒。

随着研究人员对单细胞分析日渐浓厚的兴趣， 9 月见证了一种单细胞测序方法的发表。该方法将靶向长读长纳米孔测序与基于短读长的转录组分析相结合，对由液滴分选（droplet-based partitioning）产生的条形码单细胞文库进行了测序。结果证明这是一种易于获得，且具有成本效益的高通量深度单细胞分析方法，适用于广泛的生物学挑战。

9. 首次以其天然形式测序流感病毒

9 月，RNA 病毒的完整基因组第一次以其原始形式进行测序。该研究背后的团队设计了一个接头，用于流感病毒基因组高度保守的短末端，来标靶负链 RNA，将其引入 MinION 上的蛋白质纳米孔。使用该方法，研究小组证明了对完整的流感病毒基因组的成功测序，具有 100％ 的核苷酸覆盖率，99％ 的共有一致性，以及 99％ 的读长比对匹配到流感病毒。作者指出，该方法具有识别和量化剪接变体和碱基修饰的潜力，这些变体和碱基修饰在现有方法中实际上是不可测量的。

10月，MinIT 便携式分析仪发布——它是一款搭载 MinION/Flongle 的小型超级计算机。 MinIT 致力于实现我们打破DNA测序障碍的目标，将它带给任何人，无论是在何处。

随着 MinION 性能的发展，生成序列数据的速度越来越快，我们发布了一款小型超级计算机MinIT。它带有预先配置的运行纳米孔测序实验的软件，无需配置笔记本电脑，碱基识别速度可达 150,000 个碱基/每秒。

MinIT 配备了最先进的 NVIDIA AGX 系统，比典型基于 CPU 的笔记本电脑快 7 倍，可实现实时、高通量的数据分析。预配置的控制和分析软件可以实现快速设置和简化 MinION 的操作。例如，测序仪控制软件 MinKNOW 和纳米孔数据的实时分析平台 EPI2ME 都可以在 MinIT 上运行，可在平板电脑或手机上进行操作。口袋大小的 MinIT 由主电源或单独提供的电池组供电，因此可以在实验室环境中或在现场使用。 基于强大的 GPU 技术，研究人员在挑战的环境中对 MinIT 进行了测试。研究人员使用 MinIT 在8级风暴中分析阿拉斯加海洋研究船上的海洋微生物组。而木薯病毒行动项目则描述了东非农场木薯茎的病毒含量，在三小时内即从样品中获得答案。

 - 打击破坏作物的病毒：东非的研究人员使用 MinIT 和 MinION 来表征影响木薯植物的病原体。他们在坦桑尼亚一个小农场中一棵树下的毯子上进行了他们的实验，该团队对导致木薯病的病毒进行了描述，从样品到结果的时间为三小时。为试图对抗植物病原体，以提高作物生产力的科学家和农民提供了基本信息。

- 海洋研究：一个由 11 名本科生组成的小队，在太平洋北部白令海的一艘研究船（Sikuliaq）上部署了 MinIT 和 MinION。他们在船上进行海水分析，并检查海洋微生物群落。在可能持续数周或数月的研究考察期间获取实时数据，对于寻求了解海洋生物多样性的环境科学家，以及理解气候变化如何影响海洋中的微生物将有很大用处。

11.中国第一个使用纳米孔测序的植物基因组：菊花­——传统医学基因组学的潜在兴趣来源 中国有超过 3 万种植物，拥有世界上第三大的植物资源。其中，约 11000 种药用物种是潜在传统药物基因组学的研究来源。 10 月，菊花的全基因组测序首次完成。在本文中，纳米孔测序被用于进行从头测序和组装 C.nankingense 基因组。其作为一种观赏的杂交多年生植物，具有巨大商业价值。 

它具有高度复杂的基因组，大约 3.07 Gb，具有高杂合性、高度相似的长重复序列。这也反映出纳米孔测序现在能够提供大量的读长及直接测序数据的事实。该研究还包括对重要药用菊花品种的全长转录组遗传信息的研究。 在世界的其他地方，科学家们利用纳米孔生成的高通量长读长，正持续不断地在植物基因组学界产生新的科学。在科研团体大会上，Michael Schatz 呈现了他 “100 天 100 个番茄基因组”的研究

12. 使用实时测序更快速地了解严重的肺部感染 11 月，东英吉利大学的 Justin O'Grady 研究小组发表了一篇重要的方法论文，表明纳米孔测序可用于快速鉴定肺部感染，包括耐药性表征。

世界卫生组织指出，下呼吸道感染（LRTI）是全球最致命的传染病，每年造成 320 万人死亡。如果临床医生能够快速准确地对感染做出反应，那么这些患者的结果就有可能得到改善，有许多患者正在重症监护机构接受治疗。

该团队表明，使用基于培养的方法通常需要 >48 小时的典型反应时间，并且具有其自身的局限性，这可以通过纳米孔测序将其降低至 6 小时以下。

而在世界其他地方，来自马达加斯加国家结核病项目组、巴斯德马达加斯加研究所、牛津大学、欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）和斯托尼布鲁克大学的科学家们通力合作，培训马达加斯加的科学家使用 MinION 快速检测结核病和耐药性。该项目的目标是改善诊断和治疗，同时提供疾病传播的见解。由于抗药性结核病仍然是世界各地的主要威胁，并且对马达加斯加人民构成了公共卫生威胁，这项工作至关重要。

13. 发布 Flongle 早期试用，承诺在任何环境中进行快速、小型测试

11 月，我们开始向早期试用用户发布 Flongle 。 Flongle 是 MinION 的适配器，可以在任何地点轻松执行低成本、快速、实时的测序测试。我们相信它将开辟纳米孔测序的新应用，例如快速传染病分析、按需癌症 panel 测序、食品测试或其他类型的供应链监测。在早期版本中，单个 Flongle 测序芯片产生了高达 1.8Gb 的测序数据。超过 1000 名的科学家告诉我们他们想要使用 Flongle 的新应用， 2019 年，我们期待更多。

14.新的 R10 纳米孔和其他改进推动迈向 Q50 及更高的准确度

11 月，我们在旧金山举办了纳米孔科研团体大会。作为首席技术官 Clive 技术更新演讲的一部分，他谈到了我们为推动纳米孔测序准确性所做的工作。

我们所测量的通过纳米孔的 DNA 或 RNA 信号包含着丰富的数据。我们的高性能、紧凑型电子元件能够精确测量皮安电流，随着我们不断采用尖端的机器学习算法，可以从现有信号中提取更佳的信息。

为了配合改进的算法和方法，我们还发布了一种新的纳米孔 R10。它与当前的 R9 形状不同，可以读取更长程的 DNA 信息，这使我们能够产生 Q42/Q43 的共有序列准确度和 Q50 一致性（identity）数据。在 2019 年，通过不同的方法，我们将目标瞄准 Q50，然后 Q60 的高度准确、高度连续、完整的完成基因组。

去年 12 月，马萨诸塞州综合医院 Nardini 小组的 Will Jeck 发表了一种利用纳米孔快速分析急性白血病（AML）患者样本的方法。这类疾病被分类为“肿瘤急症”，快速周转对于需要正确治疗的患者至关重要。对于我们来说，看到更多利用纳米孔实时数据的优势、有助于改善生活的方法被研发出来，是特别令人兴奋和激励人心的。在文章中，作者指出，他们“通过在测序开始 15 分钟内得到超过 100 条读长，自信地鉴定了 BCR-ABL1 融合转录物”。

我们还看到来自牛津大学医院 Schuh 小组的 Adam Burns 的精彩工作，展示纳米孔测序如何准确检测点突变、缺失和复杂的重排，为慢性淋巴细胞白血病的诊断、预后和治疗提供依据。他的工作指向了一条未来发展的道路，将传统的复杂白血病诊断途径简化为在单个纳米孔测序芯片上进行的单一检测。

随着我们继续为未来的临床应用进行监管和制造流程准备工作，我们希望在 2019 年期间分享关于这个主题的更多新闻。

软件改进是我们推动性能改进最强大的工具之一。 12 月，通过发布我们的社区单机版 GPU 加速碱基识别软件 “Guppy”，我们开始对碱基识别软件进行深度升级。我们还对主要的碱基识别算法进行了重大升级，我们将其称为 “Flip-flop 触发器”。

这些升级提供了每条读长约为 95％ 的碱基识别准确性——即原始数据的准确性，共有序列准确性将更高。用户可以对单个碱基输出进行解读，这意味着用户可以理解单个碱基识别的概率，联系上下文对是否使用参考基因组进行判断。它还具有可视化的替代识别。所有这些功能均由 GPU 加速，并与我们现有的测序化学试剂兼容。

我们一直思考的是快速简单的“样品——答案”流程，因此 Guppy 软件也包含在 MinIT（适用于MinION / Flongle），GridION 和 PromethION 中。

17. 在无数科学领域，有超过150种纳米孔发表文献

感兴趣的读者可以浏览我们官方网站的出版物区域。

在 2019 年，随着自动文库制备仪 VolTRAX、Flongle 和更多的 EPI2ME 分析软件等应用程序上线，随着 MinIT 的到来，我们相信纳米孔技术将成为一种教育工具。我们正在研究如何更好实现这一目标的方法，并始终欢迎大家就此提出宝贵意见。 与此同时，我们很高兴看到亚伯大学的高级生物学讲师 Arwyn Edwards 博士参加今年的皇家机构圣诞讲座。在那里，他与年轻观众讨论了测序和微生物组。与狗、牛、双胞胎、伦理学家、指纹专家和孩子们，以及 Alice Roberts 教授和 Aoife McLysaght 教授一起，提醒我们基因组学是一个可以传达给我们所有人的主题。 我们还漏了什么？！

感谢你们和纳米孔社区的每个人在 2018 年的支持，我们期待在 2019 年度过忙碌的一年。祝您和家人度过愉快的新年。